Новые методы исследования в бактериологии

Метод  масс-спектрометрии позволяет значительно сократить время идентификации бактериальной микрофлоры.

Используемое оборудование — анализатор bioMérieux Vitek MS (пр-во Франция).

Важнейшим разделом современной медицины являются лабораторные исследования, среди которых микробиология занимает особую роль. Это обусловлено ростом инфекционных заболеваний, бесконтрольностью применения антибактериальных препаратов и антисептиков, широким распространением штаммов микроорганизмов, устойчивых к антибиотикам расширением спектра микроорганизмов, вызывающих госпитальные инфекции. На сегодняшний день этот раздел диагностики очень востребован во всех видах медицинской помощи. Бактериологическая служба оказывает существенную помощь лечащему врачу в выборе наилучшей схемы лечения инфекционной патологии. Эффективное лечение невозможно без правильной идентификации возбудителя и определения его чувствительности к антимикробным препаратам.

В последнее десятилетие во всем мире особое значение придается развитию автоматизации микробиологических лабораторий, что позволяет выдавать более точный результат в кратчайшие сроки. С этой целью лаборатории приобретают бактериологические полуавтоматические и автоматические анализаторы, системы для экспресс-диагностики, готовые коммерческие среды. В современных условиях необходима полная автоматизация процесса идентификации микроорганизмов, определения чувствительности к лечебным препаратам с целью скорейшего выздоровления больного. Одним из последних достижений мировой науки в области микробиологии является внедрение в лабораторную практику метода масс-спектрометрии, который обеспечивает высокую производительность, полную специфичность и чувствительность, а так же непревзойденную скорость анализа.

Французская компания БИОМЕРЬЕ (BIOMERIEUX) разработала новую систему идентификации микроорганизмов на платформе MALDI TOF MS. Лабораторный комплекс получил название VITEK MS.

Такое уникальное оборудование используется в работе бактериологической лаборатории ООО «Центр независимых экспертиз» (г. Омск). Представленная в нём база данных клинически значимых видов позволяет идентифицировать микроорганизмы за несколько минут.

Принципу, лежащему в основе идентификации микроорганизмов с помощью VITEK MS, более 20 лет и называется он методом масс-спектрометрии. Главным результатом работы нового оборудования является существенное сокращение времени получения результата исследования до 1-2 суток. Использование метода спектрального анализа позволяет наиболее точно определить вид бактериальной микрофлоры. В базе данных представлены более 20 тысяч спектров микроорганизмов.

В анализаторе VITEK MS реализована революционная технология идентификации микроорганизмов методом MALDI-TOF (матричная лазерная время пролетная масс-спектрометрия) с последующим анализом спектра с помощью уникальной базы данных. Новая технология позволяет избежать предварительной длительной пробоподготовки и определяет спектр белков напрямую из бактериальной колонии, взятой с чашки первичного посева материала. VITEK MS надежно связывает информацию об образце с позицией кассеты в VITEK 2 (о котором будет сказано ниже), что облегчает как идентификацию, так и определение чувствительности к антибиотикам.

Ниже приведены ключевые термины MALDI-TOF масс-спектрометрии.
Масс-спектрометрия – метод идентификации молекул путем измерения отношения их массы к заряду в ионизированном состоянии.
MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption'lonization) – ионизация вещества с помощью матрицы и лазерного излучения.
TOF MS (Time of Flight Mass-Spectrometry) – время пролетная масс-спектрометрия. Масса молекулы оценивается по времени пролета от источника ионизации до детектора.

Для каждого вида микроорганизмов сформирован характерный набор белков (биомаркеров), полученный на основе анализа не менее 50 масс-спектров этого вида. При этом образцы получены из различных источников (больниц, лабораторий, микробиологических коллекций), а каждый образец тщательно идентифицирован с помощью сиквенса РНК или других сертифицированных методов анализа. Структурированная таким образом база данных позволяет быстро и точно идентифицировать микробиологические штаммы. Вся методика идентификации на VITEK MS состоит из 2-х этапов:
Этап 1: Подготовка образца
Анализ начинается с того, что на подложке масс-спектрометра смешивают биоматериал из колонии бактерий и специальную матрицу (2',5' дигидроксибензойная кислота). Этот раствор уже готов к использованию и устойчив к свету. Затраты по времени для подготовки 24 изолятов – 10 минут, для 96 изолятов – 33 минуты.
Этап 2: Идентификация
Образец помещают в прибор и подвергают воздействию наносекундных лазерных импульсов. При этом молекулы матрицы и аналита (белки) переходят в газовую фазу, а протонированные молекулы матрицы взаимодействуют с белками, перенося на них положительный заряд. Под действием электрического поля ионизированные белки движутся от источника ионизации к детектору с ускорениями, обратно пропорциональными их атомным массам. Программное обеспечение прибора оценивает время пролета частиц и преобразует эту информацию в спектр молекулярных масс (масс-спектр). Масс-спектр сравнивается со спектрами из базы данных и на основании сведений о массах происходит идентификация микроорганизмов. Затраты по времени для идентификации 24 изолятов – 12 минут, для 96 изолятов – 43 минуты.

Одноразовые слайды с уникальным штрих-кодом позволяют избежать внесения данных вручную, что ускоряет рабочие потоки на независимых рабочих станциях. В новом оборудовании оптимизирована загрузка образцов: микроорганизмы наносятся на слайд, добавляется матрикс и запускается процесс анализа. Расходные материалы поставляются с готовым к использованию, устойчивым на свету раствором матрикса, что экономит время на подготовку реагентов. Одновременно до 4 слайдов с 48 позициями на каждом могут быть параллельно анализированы системой, что позволяет идентифицировать192 образца за одну загрузку. Одноразовые слайды исключают риск контаминации и не требуют обработки. База данных состоит из клинически значимых видов и более 25 000 спектров. Для каждого вида микроорганизмов в базе данных присутствуют спектры большого количества штаммов

Таким образом, на идентификацию одного микроорганизма требуется меньше 2-х минут времени, при этом материалом может служить первичная колония. База данных VITEK MS состоит из более 950 клинически значимых видов (бактерий, дрожжей, плесневых грибов/дерматофитов, микобактерий) и включает большинство видов, встречающихся в ежедневной практике микробиологической лаборатории, и эта база постоянно пополняется.

Область применения довольно широка:

1. Диагностика инфекционных заболеваний человека и животных;
2. Фундаментальные научные исследования;
3. Разработка новых лекарств: анализ и сравнение белковых профилей бактериальных штаммов, устойчивых к лекарствам, для поиска новых мишеней фармакологического воздействия;
4. Стандартизация микробиологических коллекций: быстрое сравнение и классификация штаммов из различных изолятов;
5. Пищевая промышленность: анализ присутствия нежелательных микроорганизмов на ранних стадиях производства.

Однако метод масс-спектрометрии не может быть использован для определения чувствительности бактерий к антимикробным агентам. Для решения задачи комплексного подхода идентификации и определения антибиотикочувствительности компания BIOMERIEUX совместила два анализатора VITEK MS (проведение идентификации образца) и VITEK 2 (определение чувствительности к антимикробным препаратам и минимальной ингибирующей концентрации антибиотиков).

Чувствительность к антибиотикам определяет другой прибор того же производителя – VITEK-2 Compact, также применяемый ООО «Центр независимых экспертиз» в своей работе. Процесс определения чувствительности занимает в среднем 5-8 часов.

Таким образом, достигнута полная интеграция двух приборных систем –  VITEK MS – идентификация, VITEK-2 Compact – определение чувствительности. Связь приборов осуществляется производителем с помощью унифицированного программного обеспечения и технической поддержки, в том числе удалённым доступом.

В заключении необходимо отметить главные преимущества новых методов исследования в микробиологии:

1. Полная автоматизация стандартных биохимических методов идентификации микроорганизмов;
2. Непревзойдённая скорость исследования – достоверный результат в течение двух минут;
3. Высокая воспроизводимость анализа;
4. Возможность объединения в один процесс идентификации с определением чувствительности к антибиотикам;
5. Получение удалённого доступа через сеть с помощью специального программного обеспечения.

Несомненно, что на сегодняшний день использование новейшего анализатора в бактериологических исследованиях – лучшее решение для идентификации микроорганизмов и определения чувствительности к антимикробным препаратам.

Для медицинской практики это означает более эффективное и щадящее лечение больного, снижение смертности, существенное сокращение сроков госпитализации и экономию бюджетных средств.

Кузьминов А.М.
кандидат медицинских наук